TRAP染色實驗代測

TRAP染色簡介：

TRAP是酸性磷酸梅（ACP）同功酶6種同工酶（0－5）中的第5型，OC含量zui為豐富，通常作為鑒別OC的重要標志。染色目的主要作用于EDTA脫鈣的骨組織內(nèi)破骨細胞(紅色，背景藍色)，TRAP染色結(jié)果顯示OC胞漿陽性，呈酒紅色，核呈陰性。

骨組織切片及trap染色實驗步驟（僅供參考）：

1、骨組織脫鈣：新鮮骨組織固定于4%多聚甲醛24h以上。將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內(nèi)脫鈣（不能用含酸的脫鈣液脫鈣），每3天換一次脫鈣液，至骨組織針扎可以順利通過為止。

2、取材：在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)-刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應(yīng)的標簽放于脫水盒內(nèi)。

3、脫水：將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水乙醇I 30min-無水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蠟I 1h-蠟II 1h-蠟III 1h。

4、包埋：將浸好蠟的組織于包埋-機內(nèi)進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應(yīng)的標簽。于-20°凍臺冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

5、切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。 切片漂浮于攤片機40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃ 烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/span>

6、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

7、染液配制：A液：0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0：醋酸鈉1.3608g+蒸餾水100ml溶解，用冰醋酸調(diào)PH值到5.0。B液：六偶氮副品紅 4%亞硝-酸鈉：2g亞硝-酸鈉+去離子水50ml

副品紅溶液：副品紅2.5g+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml，加熱至90°溶解后過濾，4°棕色瓶保存。臨用前4%亞硝-酸鈉與副品紅溶液等比例混合。

C液：萘酚AS-BI磷酸酯20mg+N,N-二甲基甲酰胺1ml溶解。

孵育液配制：A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻，用1M NaOH或1M鹽酸調(diào)pH至5.0，再加酒石酸鉀鈉0.282g，充分溶解過濾后備用即為TRAP孵育液。

8、染色：切片置于TRAP孵育液內(nèi)37°孵育50min，鏡下觀察破骨細胞呈酒紅色為止。蒸餾水漂洗。

9、蘇木素染細胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。

10、脫水封片：將切片依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

11、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

染色結(jié)果：EDTA脫鈣的骨組織內(nèi)破骨細胞(紅色，背景藍色)

TRAP染色實驗代測