免疫熒光雙標三色（切片）

服務介紹：

免疫熒光雙重標記即利用抗原抗體特異性結合原理，在同一張切片上兩個抗原進行同時標記，從而實現定位，定性，半定量的分析。

實驗流程：

　　異源雙標：

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min至沸，停火8min，轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3、 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4、 血清封閉:在圈內滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加驢血清）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，兩種一抗按一定的稀釋比例混合，滴加到組織上，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬標記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。（兩種二抗，按照一定的比例混合孵育）

7、 DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、 自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

9、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光，綠光 。

　　同源雙標：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3、 畫圈,雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4、 血清封閉: 甩干PBS, 滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

6 、加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7 、加CY3-TSA（或FITC-TSA）：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8 、微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

9、 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

10、 加對應的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11、 DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

12、 自發熒光淬滅：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

13 、封片：切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

14 、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光.

同源雙標技術原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。技術主要原理為熒光標記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變為活化的酪胺，附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結合是共價結合，而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結合，通過微波修復處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標記的酪胺依然附著在靶標周圍。在檢測第二個靶標時，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產生交叉反應。只需變化不同熒光標記即可實現多個靶標的標記。通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色

送樣運輸要求：

1.冰凍切片-20℃保存和運輸。

2.石蠟切片常溫運輸至實驗室。

3.細胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌后用無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸到實驗室