在發(fā)明蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）出現(xiàn)了30多年之后，這項(xiàng)技術(shù)仍然是獲取特定蛋白可靠鑒定的關(guān)鍵。許多近期涌現(xiàn)的產(chǎn)品利用各種方法來(lái)提高蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性、敏感性、定量性以及速度。

有三個(gè)人都被認(rèn)為發(fā)展了蛋白質(zhì)的免疫印跡方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白質(zhì)印跡法）”的命名者，他就是當(dāng)時(shí)在西雅圖哈欽森癌癥研究中心Bob Nowinski實(shí)驗(yàn)室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，使用膠、尼龍膜和吸水紙去鑒定一個(gè)復(fù)雜個(gè)體中特定的DNA序列）、Northern Blotting（隨后發(fā)明出的相似策略，用于鑒定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski實(shí)驗(yàn)室三者之意。

Burnette的技術(shù)成果直到1981年才得以發(fā)表。他回想起來(lái)，當(dāng)時(shí)審稿人“特別”反對(duì)使用“Western blotting”這一名稱。但盡管如此，這個(gè)名稱還是沿襲了下來(lái)，而且蛋白質(zhì)印跡技術(shù)也成為了zui廣泛使用的免疫化學(xué)技術(shù)之一。

工作原理

蛋白質(zhì)印跡法的*步涉及到用凝膠電泳（Gelelectrophoresis）按照大小分離蛋白質(zhì)，然后通過(guò)將膜置于膠上，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上（通常是硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水紙，然后將這套堆層放在緩沖溶液中，這樣就能通過(guò)毛細(xì)管作用將蛋白質(zhì)向上拉拽到膜上。這也就是所謂的濕法或槽式轉(zhuǎn)印法。

另外兩項(xiàng)技術(shù)是干法和半干轉(zhuǎn)印法，這兩種方法比傳統(tǒng)的濕轉(zhuǎn)印法更快也更規(guī)整，但是對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)而言，效率更低。對(duì)于半干轉(zhuǎn)印方法來(lái)說(shuō)，膜和膠放置在被緩沖液浸泡過(guò)的濾紙層之間，將這些都夾在陰極和陽(yáng)極之間，電流就能驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。三種方法中，干法轉(zhuǎn)印zui快，但轉(zhuǎn)印效率也zui低。

轉(zhuǎn)印結(jié)束后，膜被放在稀釋過(guò)的蛋白質(zhì)溶液中用來(lái)封閉非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合。然后將膜與一抗進(jìn)行孵育、洗脫，再與標(biāo)記了信號(hào)檢測(cè)探針的二抗進(jìn)行孵育。

zui后一步是檢測(cè)，通常采用化學(xué)發(fā)光或者熒光方法。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，與酶交聯(lián)的二抗能夠與檢測(cè)抗原產(chǎn)生光發(fā)生反應(yīng)，可以被膠片或成像裝置捕獲。而在熒光檢測(cè)中，抗體探針被熒光集團(tuán)所標(biāo)記。

熒光檢測(cè)方法的主要優(yōu)勢(shì)在于，它可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白質(zhì)，并且其信號(hào)更加一致。因此與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相比，也更有利于量化研究。

不少制造蛋白質(zhì)印跡相關(guān)設(shè)備、軟件和消耗品的公司正在努力推動(dòng)其中一些或所有步驟的自動(dòng)化，期望能夠?qū)⑦@一實(shí)驗(yàn)變得更加簡(jiǎn)單有效。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中加入了一些驗(yàn)證點(diǎn)，讓研究人員能夠隨時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，甚至重新打造整個(gè)過(guò)程。科學(xué)家們尋求的是性、穩(wěn)健性和策略化，從而能夠幫助他們避免浪費(fèi)寶貴的造價(jià)高昂的抗體。

加速免疫檢測(cè)過(guò)程

轉(zhuǎn)印、抗體孵育、上樣和洗脫步驟占據(jù)了蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)80%的時(shí)間，EMD Millipore公司“蛋白質(zhì)印跡法解決方案”產(chǎn)品Michele Hatler這樣介紹。

這家總部位于加州泰梅庫(kù)拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)加速了整個(gè)過(guò)程，使用真空裝置通過(guò)膜推入試劑，而不僅僅依賴于擴(kuò)散作用。這樣就能將免疫檢測(cè)的時(shí)間從4小時(shí)縮短到30分鐘，Hatler表示。她解釋說(shuō)：“我們真正致力于提高蛋白質(zhì)印跡工作流程的效率。我們?nèi)匀皇前凑諅鹘y(tǒng)的步驟走，只是加了一個(gè)真空裝置。”

Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)。它可以使用中等大小的凝膠（8.5×13.5厘米）和迷你凝膠（7.5×8.4厘米），之前則只能用迷你凝膠。

“這一設(shè)備很便宜，操作也很簡(jiǎn)便，但切實(shí)提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。” Hatler說(shuō)。

伯樂(lè)公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)臺(tái)面大小的儀器，能夠提供快速而的轉(zhuǎn)印。得益于新的轉(zhuǎn)印緩沖液配方，特殊的過(guò)濾材料和增強(qiáng)的電流強(qiáng)度（由一個(gè)集成電源調(diào)節(jié)），這一系統(tǒng)能夠在短至3分鐘的時(shí)間內(nèi)完成轉(zhuǎn)印，并且印跡結(jié)果能與槽式轉(zhuǎn)移相媲美。傳統(tǒng)的半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)需要15到60分鐘時(shí)間，而且通常無(wú)法提供高分子量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的有力結(jié)果。

增加驗(yàn)證點(diǎn)以緩解憂慮

蛋白質(zhì)印跡法的高失敗率常常令人感到非常沮喪，尤其是你需要若干天來(lái)?yè)Q取一個(gè)結(jié)果。“這是一項(xiàng)非常不穩(wěn)定的技術(shù)，”伯樂(lè)公司“蛋白質(zhì)印跡組”市場(chǎng)Ryan Short說(shuō)，“我們對(duì)用戶調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，一半的用戶報(bào)告他們用此技術(shù)的失敗率至少是25%。”

Short還說(shuō)：“幾乎沒(méi)有什么機(jī)會(huì)可以檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程是否滿足期望。由此就產(chǎn)生了焦慮。我們正在引入可視驗(yàn)證點(diǎn)的概念來(lái)增加信心和確定性。”

這家公司的標(biāo)準(zhǔn)和Mini-PROTEAN免染色預(yù)制膠，利用其ChemiDoc MP膠成像系統(tǒng)，使得研究者可以快速觀測(cè)到他們的蛋白是否正確地載入到凝膠上，進(jìn)而確證高質(zhì)量的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，便于決定是否應(yīng)該轉(zhuǎn)向下一個(gè)步流程或是重新開(kāi)始。ChemiDoc MP系統(tǒng)是為化學(xué)發(fā)光和多元熒光斑點(diǎn)成像技術(shù)所設(shè)計(jì)，能夠在個(gè)人電腦上用ImageLab軟件來(lái)操作。

這些驗(yàn)證點(diǎn)“真的很有用”，在實(shí)驗(yàn)室使用該系統(tǒng)的加州大學(xué)戴維斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我們可以成像這些免染的凝膠，不用加入額外的染料，而且能夠快速判斷跑在膠上的樣品是否出現(xiàn)問(wèn)題。我們還能在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜之后再去對(duì)凝膠成像，如果其中任何一個(gè)步驟出現(xiàn)問(wèn)題，我們都可以在這一點(diǎn)上停止實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。”

成像和軟件提高定量性

當(dāng)許多科學(xué)家仍在使用膠片分析蛋白質(zhì)印跡時(shí)，世面上開(kāi)始出現(xiàn)越來(lái)越多的寬范圍免膠片凝膠記錄成像系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以用來(lái)成像并分析化學(xué)發(fā)光的印跡、熒光的印跡斑點(diǎn)或者同時(shí)檢測(cè)這兩種印跡。許多公司開(kāi)始紛紛努力，爭(zhēng)相制造盡可能便捷的成像儀及其分析軟件。很多公司提供了按鍵式成像捕捉系統(tǒng)，其大小可在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上操作。

Syngene公司于2012年4月推出了非常簡(jiǎn)潔的一鍵操作系統(tǒng)PXi，分析化學(xué)發(fā)光和熒光印跡。該系統(tǒng)是基于該公司的G:BOX成像系統(tǒng)，并配有GeneSys成像軟件。

2012年10月，賽默飛世爾公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像儀，使用紫外和可見(jiàn)光透射法，專業(yè)的濾鏡和電荷耦合器件（CCD）攝影技術(shù)去捕獲和分析蛋白質(zhì)印跡以及蛋白和核酸凝膠。

CCD照相機(jī)的靈敏度比X射線膠片高兩倍，據(jù)該公司介紹，該儀器的動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)10倍。用戶只需簡(jiǎn)單地按下觸摸屏上其中一個(gè)*預(yù)設(shè)按鈕，無(wú)需調(diào)焦或調(diào)節(jié)照相機(jī)的設(shè)置。用戶也可以設(shè)置定制曝光，并可同時(shí)設(shè)置多達(dá)5個(gè)不同的曝光，或者使用預(yù)設(shè)的曝光參數(shù)。這臺(tái)成像儀占用的儀器空間很小，可以在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上使用。

Aplegen公司的Omega Lum G凝膠記錄系統(tǒng)也具有自動(dòng)聚焦的特點(diǎn)，可以在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上操作，并配備了一臺(tái)整合的平板電腦。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像儀，其特色在于整合的電腦和觸摸屏，允許用戶調(diào)節(jié)曝光、光圈、放大縮小和焦距等參數(shù)，當(dāng)用戶按下實(shí)時(shí)預(yù)覽（Live Preview）按鈕時(shí)，還能提供圖像實(shí)例。

LI-COR公司的紅外成像系統(tǒng)版本是Odyssey CLx，該版本具有超過(guò)6對(duì)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍，而前一個(gè)版本只具有超過(guò)4對(duì)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍。當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進(jìn)行解析時(shí)，這一增大的范圍能消除飽和度，提供了更寬的線性范圍可以轉(zhuǎn)換為定量數(shù)據(jù)。

“研究者在他們的印跡中不僅不會(huì)達(dá)到飽和，而且他們還可以將多重印跡結(jié)果放進(jìn)成像儀中，根本無(wú)須擔(dān)心為這些印跡進(jìn)行不同的設(shè)置調(diào)整。”位于林肯市的Nebraska公司產(chǎn)品市場(chǎng)Jeff Harford解釋說(shuō)。

Rehana Leak是位于匹茲堡的美國(guó)迪尤肯大學(xué)（Duquesne University）的助理教授，她使用LI-COR的Odyssey CLx系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞如何適應(yīng)低水平脅迫的研究。“Odyssey成像儀的優(yōu)勢(shì)在于它是16位的成像儀，并且具有700和800納米兩個(gè)紅外波長(zhǎng)，一次能夠成像兩個(gè)斑點(diǎn)。” Leak說(shuō)，“這意味著我們可以一起檢測(cè)磷酸化和全部構(gòu)象的蛋白。”兩個(gè)蛋白亞型通過(guò)其他方法很難進(jìn)行同步區(qū)分，因?yàn)樗鼈兊幕鶊F(tuán)非常相似。

Leak指出，Odyssey成像儀能夠可視化216個(gè)紅外線信號(hào)暗影，與之相比，X射線膠片只能灰度的呈現(xiàn)150個(gè)暗影。“這將從150個(gè)躍遷到65000個(gè)紅外暗影，因此這種方法可以獲取更高的分辨率。”她接著說(shuō)，“這是不同尋常的定量化。”

2012年12月，LI-COR公布了一套新的數(shù)字成像系統(tǒng)，即C-DiGit系統(tǒng)，能夠用于化學(xué)發(fā)光印跡。該系統(tǒng)將于2013年推出。“就像zui近這些年數(shù)碼照相機(jī)取代膠片相機(jī)一樣，我們認(rèn)為C-DiGit系統(tǒng)必將替代膠片化學(xué)發(fā)光。” LI-COR資深科學(xué)家Jon Anderson說(shuō)，“這項(xiàng)技術(shù)能提供膠片用戶所習(xí)慣的所有靈敏度和圖像質(zhì)量，同時(shí)顯著提升了數(shù)字圖像的質(zhì)量。”

軟件始終保持直觀

傳統(tǒng)的軟件分析蛋白質(zhì)印跡時(shí)需要用戶從圖像向電子表格導(dǎo)出數(shù)據(jù)，而后續(xù)的均一化計(jì)算和分析都由手動(dòng)完成。BioRad于2012年9月發(fā)布的Image Lab 4.1軟件，針對(duì)看家蛋白或總上樣蛋白提供嵌入式、自動(dòng)化的均一化。

“這是目前我在市面上見(jiàn)到的的產(chǎn)品之一。”Gomes說(shuō)，他正在研究蛋白酶體和肌鈣蛋白在心臟和骨骼肌組織中的作用。“的一點(diǎn)是，它是*免費(fèi)的。”Image Lab 4.1軟件比他之前在實(shí)驗(yàn)室用過(guò)的圖像分析軟件都要簡(jiǎn)便，Gomes接著說(shuō)，幾乎每個(gè)人都能掌握。“這的確增強(qiáng)了我們定量蛋白質(zhì)的方法。”

LI-COR公司也已經(jīng)推出了新的成像軟件——Image Studio，能與其Odyssey系統(tǒng)一起使用。用戶只需選擇一個(gè)檢測(cè)通道，然后按一個(gè)按鈕就能獲得一張圖像。這個(gè)軟件的新版本提供毫米間隔的分析，而不是厘米間隔的，同時(shí)又能夠執(zhí)行*的自動(dòng)和手動(dòng)分析。

重新打造蛋白質(zhì)印跡

除了對(duì)傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)進(jìn)行微調(diào)，ProteinSimple公司的Simple Western系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了重新開(kāi)發(fā)，用毛細(xì)管電泳使整個(gè)過(guò)程*自動(dòng)化。在2011年，該公司推出了Simon，計(jì)劃使用該儀器全面取代蛋白質(zhì)印跡法。Simon能夠基于大小進(jìn)行分離、免疫檢測(cè)、洗滌、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和定量分析。科學(xué)家們僅需要加上樣品，然后離開(kāi)，稍后回來(lái)就能得到*分析好的數(shù)據(jù)。Simon甚至能夠發(fā)出蜂鳴聲告知用戶結(jié)果出來(lái)了。

該公司緊接著在2012年初推出了Sally，該儀器允許用戶在一次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行96個(gè)Simple Western。而的設(shè)備則是2012年9月推出的Peggy，能夠一次分析96個(gè)樣品，并能按照尺寸或電荷分離蛋白。Simple Western克服了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法中手動(dòng)部分的缺陷，比方說(shuō)缺少重復(fù)性或定量化結(jié)果。此外，在傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法中，多重檢測(cè)已經(jīng)成為一種挑戰(zhàn)。研究者現(xiàn)在可以利用熒光去觀測(cè)一個(gè)樣品中的2個(gè)或3個(gè)蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移的設(shè)備可以一次同時(shí)跑8塊迷你膠或4塊中等大小的膠，但這已經(jīng)是傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法所能達(dá)到的極限。Simple Western能夠在每個(gè)毛細(xì)管中多重分析蛋白質(zhì)，從而在本質(zhì)上消除傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法的限制。

對(duì)于斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的腫瘤學(xué)教師Alice Fan來(lái)說(shuō)，Simple Western技術(shù)zui令人興奮的事情在于它分析顯微級(jí)別樣品的能力。

Fan收集樣本組織樣本的時(shí)間已經(jīng)超過(guò)10年，她一直在等待那個(gè)能夠讓她分析腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組的工具，而且還無(wú)需用去整個(gè)樣品。“我找尋了多年，希望有一個(gè)設(shè)備能夠用極少量的組織進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。”她解釋說(shuō)。

除了幫助她保存之前儲(chǔ)存的組織之外，Sally還讓Fan可以使用細(xì)針穿刺法多次從樣本身體中提取一些樣本，而不是做全面的活體檢視。Fan希望，這將能夠幫助她實(shí)時(shí)觀測(cè)樣本的腫瘤對(duì)藥物產(chǎn)生的反應(yīng)。“在描述不同類型的腫瘤方面，這真的對(duì)我的研究大有裨益。這是巨大的進(jìn)步。”

默克公司（Merck & Co）疫苗生物化學(xué)團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人Richard Rustandi在2011年底購(gòu)入了一臺(tái)Simon儀器。當(dāng)時(shí)，他并沒(méi)有抱有很高的期待。但是，他說(shuō)，他得到了意外的驚喜。“這臺(tái)儀器太棒了，我們?cè)趲讉€(gè)月后又買了一臺(tái)。”

據(jù)Rustandi介紹，盡管Simon并不是無(wú)瑕的，但它能夠真正實(shí)現(xiàn)定量化。他接著說(shuō)，手動(dòng)的蛋白質(zhì)印跡法通常具有35%到45%的變異率，但他和他的實(shí)驗(yàn)室能夠?qū)imon的變異率控制在10%以下。

隨著蛋白質(zhì)印跡技術(shù)地不斷演化，研究者zui終不用像保姆一樣，花費(fèi)大量的時(shí)間照看著他們的實(shí)驗(yàn)。“他們的時(shí)間非常重要。” Simple Western的產(chǎn)品Peter Fung認(rèn)為，“你的時(shí)間利用率越高，就越能做出好的研究。”