抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步驟

抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是破骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，特異性分布于破骨細(xì)胞中。TRAP染色試劑盒即是用于顯示組織中的破骨細(xì)胞。其中基本原理在于，在含酒石酸的酸性條件下，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解，產(chǎn)生的萘酚AS-BI與六偶氮副品紅結(jié)合，形成非水溶性的酒紅色物質(zhì)沉積在酶活性原位，從而實現(xiàn)對抗酒石酸酸性磷酸酶的顯色和定位。本產(chǎn)品基本組成成分：反應(yīng)緩沖液主要成分為醋酸緩沖液及酒石酸鉀鈉，pH約5.0；副品紅溶液，含5%副品紅；亞硝酸鈉溶液主要成分為4%亞硝酸鈉；AS-BI磷酸鹽底物溶液，主要成分為20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸鹽。經(jīng)本產(chǎn)品染色后，破骨細(xì)胞中的TRAP呈酒紅色，定位于細(xì)胞漿。按照切片上每個組織點300 μL用量，本試劑盒可以做50次以上TRAP染色。

儲存與運輸：冰袋（wet ice）運輸；2-8℃避光保存，其中AS-BI磷酸鹽底物溶液-20℃保存，有效期12個月。

配制TRAP工作液：

（1）取50 μL副品紅溶液（G1050-2）與50 μL亞硝酸鈉溶液（G1050-3）在潔凈離心管中混勻，得到六偶氮副品紅溶液；

（2）向第1步的100 μL六偶氮副品紅溶液中加入100 μL AS-BI磷酸鹽底物溶液（G1050-4），吹吸數(shù)次充分；

（3）吸取1.8 mL反應(yīng)緩沖液（G1050-1）加入到第2步的混合液中充分混勻；

（4）第3步的混合液經(jīng)針式濾器過濾（0.45 μm水系濾膜）即得到TRAP工作液。

注意：務(wù)必按照所屬順序配制工作液。每個組織點大約需要200-300 μL工作液，根據(jù)使用量配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，避免浪費。

石蠟切片操作步驟（供參考）

1. 石蠟切片脫蠟至水，純水洗數(shù)分鐘。

2. 將切片用組化筆化圈后放在（加有一定量的防止切片蒸干的純水）濕盒中，用純水37℃孵育2 h。

3. 切片孵育完成后傾去純水，滴加過濾好的TRAP工作液覆蓋組織，置于37℃避光反應(yīng)20-30 min。

4. 復(fù)染細(xì)胞核：傾去孵育液并水洗，以蘇木素染液進(jìn)行染核。

5. 脫水，透明，以中性樹膠封片。

細(xì)胞爬片操作步驟（供參考）

1. 細(xì)胞固定：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4%多聚醛固定15-30 min，蒸餾水洗3次。

2. 細(xì)胞破膜：以0.2% Triton X-100溶液覆蓋細(xì)胞進(jìn)行破膜處理20-30 min，蒸餾水輕洗3遍。

3. 孵育染色：將TRAP工作液加到細(xì)胞孔板內(nèi)覆蓋細(xì)胞，37℃避光孵育20 min，蒸餾水洗3次。

4. 細(xì)胞核復(fù)染：吸除孵育液并水洗，以蘇木素染液進(jìn)行染核。

5. 加入適量無水乙醇脫水，取出孔板中的蓋玻片，吹風(fēng)機(jī)吹干，倒扣在潔凈的載玻片上以中性樹膠封片。

實驗流程：脫蠟至水—染液配制-Trap染色-蘇木素淺染核-脫水封片-顯微鏡鏡檢 　　

結(jié)果判讀：破骨細(xì)胞呈酒紅色或淺紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步驟