原位雜交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)流程和樣本處理注意事項(xiàng)

上海信帆提供原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)。原位雜交實(shí)驗(yàn)通常流程由組織切片+探針+DAB染色+掃片或者拍照構(gòu)成，那么詳細(xì)的操作步驟和對(duì)樣本的處理要求具體是什么呢，讓我們一起來探索一下吧！

實(shí)驗(yàn)流程：

　　1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

　　3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　6、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

　　7、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

　　8、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。

　　9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　10、滴加封閉液：滴加封閉血清 BSA。室溫30min。

　　11、滴加鼠抗高辛標(biāo)記過氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

　　12、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

　　13、復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

　　14、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

　　15、顯微鏡檢，圖像采集分析。

　　結(jié)果判讀：

　　陽性為棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過長影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。

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