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Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其實(shí)比實(shí)驗(yàn)本身更重要！好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以事半功倍，節(jié)省時間！尤其做生物實(shí)驗(yàn)，一定要查詢盡可能的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)路線。當(dāng)然實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對于一個real-time qPCR而言，首先就是實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計(jì)，這步至關(guān)重要，好的引物是實(shí)驗(yàn)本身成功的50%；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨(dú)說明）。

1. 實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備

以最基本的基因表達(dá)差異分析為例。實(shí)驗(yàn)材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計(jì)意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。

一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材。現(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2. 引物設(shè)計(jì)

一般real-time PCR引物的設(shè)計(jì)遵循下面一些原則：

擴(kuò)增產(chǎn)物長度在80-150bp。

引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。

產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。

G+C含量在40%-60%之間。

堿基要隨機(jī)分布。

引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。

引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。

引物5’端可以修飾。

引物3’端不可修飾。

引物3’端要避開密碼子的第3位。

Taqman@探針的設(shè)計(jì)稍有不同，一般有公司設(shè)計(jì)合成。遵循下面以下原則：

盡量靠在上游引物；

長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；

5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量

Real-time qPCR操作過程

1. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：

（1）全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。

（2）使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。

（3）在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水漂洗干凈后高壓滅菌備用。

當(dāng)然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進(jìn)行RNA的提取。

2. Mix配制

一般來講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：

（1）MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。

（2）更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

（3）每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！

（4）所有成分加完后，離心去除氣泡。

（5）每個樣品至少3個平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標(biāo)了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。

參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候，進(jìn)行熒光信號的收集。

3. 儀器設(shè)置

所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：

A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke"，進(jìn)行“定量"實(shí)驗(yàn)。

B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。

C. 目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。

D. 樣品的設(shè)置：包括哪個是實(shí)驗(yàn)組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。

E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備

F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。

G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：

A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none"。設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！

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