NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF的正確操作！

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得.它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個(gè)螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過(guò)一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來(lái)，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有*的親和力，可達(dá)5-20mg/ml。可在非變性和變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白。純化程序簡(jiǎn)單，所得的蛋白純度可高達(dá)95％。Ni-NTA可再生4-6次，重復(fù)使用。

Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預(yù)先偶聯(lián)Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標(biāo)簽蛋白的優(yōu)選金屬離子，用咪唑進(jìn)行洗脫。我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結(jié)合，經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質(zhì)親和非常弱的情況下應(yīng)該避免，因?yàn)樗梢越档徒Y(jié)合強(qiáng)度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。如果重組組氨酸標(biāo)簽蛋白表達(dá)為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達(dá)6M Gua-HCl或8M尿素。當(dāng)使用高濃度的尿素或Gua-HCl時(shí)，通常發(fā)生蛋白質(zhì)解折疊。包涵體變性復(fù)性是個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，一般的建議純化可溶蛋白。

注意事項(xiàng)：

1.上樣之，樣品必須經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾及去除色素，否則雜質(zhì)及色素會(huì)被吸附到填料上，影響填料的正常使用。

2.在使用過(guò)程中，避免使用高濃度的強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酸和堿的濃度應(yīng)低于 0.1 摩爾。堿會(huì)使流速變慢。

3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行。