一：
WB實驗代測的優(yōu)勢：
下面我們就做WB實驗代測的原理以及大致需要的操作做了一個匯總。
1、western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
2、與southern或northern雜交方法類似，但western免疫印跡采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。
3、經(jīng)過page分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。
4、以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。
二：WB實驗代測的操作步驟：
1、蛋白質(zhì)樣品獲得：細菌誘導(dǎo)表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
2、WesternBlot實驗電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。
3、WesternBlot實驗轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）
4、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡。
5、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
6、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、NC膜、凝膠、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜準(zhǔn)確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。
7、接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡實驗。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后。
8、在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。
總結(jié)：實驗代測中的優(yōu)勢及操作步驟，看完本文您就應(yīng)該有了基本的認識和了解相信大家都明白了吧！總的來說，希望對大家有所幫助。
更新時間：2020-08-19 
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