MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

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明膠酶譜法試劑盒檢測(cè)步驟：

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照

3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。

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MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

使用上海信帆生物明膠酶譜法試劑盒發(fā)表的文章：

《綠茶多酚EGCG增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其相關(guān)機(jī)制研究》

*部分綠茶多酚EGCG增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列研究嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩(wěn)定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實(shí),急性冠脈綜合征發(fā)病的zui主要病理生理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈中不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yán)重的缺血、缺氧。近年來(lái),多項(xiàng)研究流行病學(xué)研究報(bào)道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發(fā)病率。綠茶的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量zui多的為兒茶素。綠茶中兒茶素主要成分包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG),表沒(méi)食子兒茶素(EGC)和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量zui豐富,活性zui強(qiáng),已被證明具有多種藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性。我們進(jìn)行本研究主要目的就是為了證實(shí)綠茶多酚EGCG是否能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。

方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體重18-20g)被隨機(jī)分為對(duì)照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yǎng)。EGCG組以及對(duì)照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進(jìn)行腹腔注射共16周。隨后麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂干動(dòng)脈并予固定石蠟包埋。小鼠頭臂干橫切面進(jìn)行HE染色以及Masson染色分別評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形態(tài)以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學(xué)染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞成分的比例。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)用來(lái)檢測(cè)斑塊中蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法用來(lái)檢測(cè)斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。

zui后,我們用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清炎癥因子單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及干擾素-γ(IFN-γ)水平。結(jié)果:高脂飲食喂養(yǎng)16周后,ApoE缺陷小鼠頭臂干動(dòng)脈近端橫切面HE染色可見(jiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,提示造模成功。另外,與對(duì)照組相比,EGCG組ApoE缺陷頭臂干動(dòng)脈近端粥樣硬化病變程度明顯減輕。Masson染色結(jié)果提示,EGCG干預(yù)后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中膠原成分明顯增加。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)EGCG組斑塊中巨噬細(xì)胞比例明顯降低,而斑塊中平滑肌成分顯著增高。此外,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EGCG可以顯著降低ApoE缺陷小鼠斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)的表達(dá)。同樣,明膠酶譜法結(jié)果提示EGCG組斑塊中MMP-2和-9活性較對(duì)照組明顯減低。

zui后,與對(duì)照組相比,EGCG腹腔注射后,ApoE缺陷小鼠血清炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平顯著降低。結(jié)論:本研究結(jié)果提示,綠茶多酚EGCG能夠增強(qiáng)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。此外,EGCG增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的內(nèi)在機(jī)制可能與其抑制多種炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及機(jī)制金屬蛋白酶表達(dá)有關(guān)。第二部分EGCG通過(guò)與67LR相互作用抑制巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)目的:大量研究資料表明在不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化破裂過(guò)程中,由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)以及基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是綠茶中zui主要的多酚類化合物,資料顯示EGCG具有多種藥理學(xué)活性并且能夠?qū)π难馨l(fā)揮保護(hù)性作用。

近年來(lái),實(shí)驗(yàn)已證實(shí)相對(duì)分子量為67000的層粘連蛋白受體(67LR)為EGCG主要膜表面受體,EGCG與67LR相互作用后可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究的主要目的就是為了評(píng)估EGCG是否能夠抑制佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞 EMMPRIN 以及 MMP-9 的表達(dá),并且探討其可能的相關(guān)機(jī)制。方法:使用不同濃度的EGCG預(yù)處理人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞1小時(shí)后,以佛波酯(PMA,100nmol/L)誘導(dǎo)48小時(shí)使其分化為巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中使用小干擾RNA(Small-interfering RNA,siRNA)沉默EMMPRIN基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-Time PCR)測(cè)定 EMMPRIN 和 MMP-9 mRNA 表達(dá),蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)EMMPRIN以及MMP-9蛋白表達(dá),使用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9的活性。

結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)EGCG(10-50μmol/L)可以明顯抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9的表達(dá),抑制作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,隨著EGCG濃度的增加,其抑制作用明顯增強(qiáng)。Extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)、p38 以及c-Jun N-terminal kinase(JNK)信號(hào)通路與EMMPRIN和MMP-9的表達(dá)密切相關(guān),EGCG同樣能夠顯著抑制ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。

使用基因沉默的方法下調(diào)巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)可以使MMP-9的表達(dá)以及活性明顯下降,提示在EGCG主要通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN合成進(jìn)而抑制MMP-9的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明EGCG是否通過(guò)67LR相互作用發(fā)揮其抑制EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的作用,我們使用67LR抗體封閉巨噬細(xì)胞表面67LR以阻斷EGCG與67LR的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)巨噬細(xì)胞EMMPRIN以及MMP-9表達(dá)的抑制作用明顯減弱,同樣67LR抗體阻斷了 EGCG對(duì)于ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。

結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,EGCG可以通過(guò)抑制ERK1/2、p38以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而降低巨噬細(xì)胞EMMPRIN和MMP-9表達(dá),這些生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)EGCG與67LR相互作用介導(dǎo)的。另外,研究發(fā)現(xiàn)在EGCG抑制MMP-9表達(dá)的過(guò)程中,EMMPRIN發(fā)揮著主要作用。以上研究結(jié)果提示綠茶多酚EGCG可能成為一種穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的治療劑。

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