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中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書

測定意義：
NP 在一定的溫度和中性pH 條件下，催化水解蛋白質。由于其安全無毒、水解能力強、作
用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生物試劑。
測定原理：
中性條件下，NP 催化酪蛋白水解產生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生
成鎢藍；在680nm 有特征吸收峰。
自備儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、
1.5 mL EP 管和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加4mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入4mL 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加20mL 蒸餾水溶解。
試劑五：液體4mL×1 瓶，4℃保存。
標準品：液體1mL×1 支，0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，
加入1mL 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定。
3. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建
議500 萬細胞加入1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3 秒，間隔7
秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長到680 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。
3. 對照管：取0.5 mL EP 管，加入20μL 粗酶液，40μL 試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫
10min；加入40μL 試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取40μL 上清液，加入新的EP
管，再加入200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL 于微
量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm 測定光吸收，記為A 對照管。
4. 測定管：取0.5 mL EP 管，加入20μL 粗酶液，40μL 試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫
10min；加入40μL 試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取40μL 上清液，加入新的EP
管，再加入200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL 于微
量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm 測定光吸收，記為A 測定管。（注意與空白管不同，先加
試劑三，后加試劑二）
5. 空白管：取0.5 mL EP 管，加入40μL 蒸餾水，200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻后置于
30℃水浴保溫20min，取200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm 測定光吸收，記為A
空白管。
6. 標準管：取0.5 mL EP 管，加入40μL 標準品，200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻后置于

30℃水浴保溫20min，取200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm 測定光吸收，記為A
標準管。
注意：空白管和標準管只需要測定一次。

中性蛋白酶檢測試劑盒使用說明書計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
NP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
NP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1 nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W
（3）按照液體體積計算
NP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×
稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
（4）按照細胞數(shù)量計算
NP 活性單位定義：30℃每104 個細胞每分鐘催化水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /104 cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白
管）÷細胞數(shù)量
C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液
蛋白質濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定，需要另外測定；建議
稱取同樣質量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質含量測定試劑盒
測定；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：
粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min。
b.使用96 孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
NP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
NP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1 nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W
（3）按照液體體積計算
NP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×
稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
（4）按照細胞數(shù)量計算
NP 活性單位定義：30℃每104 個細胞每分鐘催化水解產生1nmol 酪氨酸為1 個酶活單位。
NP 活性（nmol/min /104 cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）


×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白
管）÷細胞數(shù)量
C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液
蛋白質濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定，需要另外測定；建議
稱取同樣質量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質含量測定試劑盒
測定；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：
粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min。
注意事項：
臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3 天內使用完畢。

中性蛋白酶檢測試劑盒使用說明書