信帆生物手把手教你做Real-time qPCR實驗

Real-time qPCR實驗設計
實驗設計其實比實驗本身更重要！好的實驗設計可以事半功倍，節省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢盡可能*的相關資料，整理好思路，設計好實驗路線。當然實驗過程中出現各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創新。對于一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和準備；然后引物設計，這步至關重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進行實驗和數據分析（這一部分單獨說明）。

1.  實驗材料的處理和準備
以zui基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內要有生物重復，可以數據分析此處理是否有統計意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于定量的樣品）。
一般傳統的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材。現在新技術的發展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2.  引物設計
一般real-time PCR引物的設計遵循下面一些原則：
擴增產物長度在80-150bp。
引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。
產物不能形成二級結構。
產物長度一般在15-30堿基之間。
G+C含量在40%-60%之間。
堿基要隨機分布。
引物自身不能有連續4個堿基的互補。
引物之間不能有連續4個堿基的互補。
引物5’端可以修飾。
引物3’端不可修飾。
引物3’端要避開密碼子的第3位。
Taqman@探針的設計稍有不同，一般有公司設計合成。遵循下面以下原則：
盡量靠在上游引物；
長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量

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Real-time qPCR操作過程

1.  RNA提取和反轉錄
在抽提RNA過程中任一環節的不正確操作都可能導致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難*抑制，預防其污染是十分必要的。在實際的操作中應遵循下面一些原則：

（1）全程佩戴一次性手套。皮膚經常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。

（2）使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。

（3）在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水*漂洗干凈后高壓滅菌備用。
當然，這些也不是的要求。如果是操作熟練。*可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進行RNA的提取。

2.  Mix配制
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到一個*反應體系。在反應體系配置過程中，有下面幾點需要注意：

（1）MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，溶解后放在4度。

（2）更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。能在冰上操作。

（3）每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！

（4）所有成分加完后，離心去除氣泡。

（5）每個樣品至少3個平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的注冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，在PCR擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。

3.  儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為后面的定量做準備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。
G. 反應體系的設置：

A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。設置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！

Real-time qPCR數據分析
1.  Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個循環的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。

2.  影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的zui主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3.  如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
 

另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。
 

標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是zui常用的度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250。

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